<<trends in CELL BIOLOGY>>
c-Abl在细胞周期、压力应答、神经中的细胞功能
Richard A.Van Etten
[c-Abl Abelson小鼠白血病毒中细胞恶性转化基因的同源基因的产物，因为有暗示c-Abl与几种人类白血病有关，弄清楚Abl的功能非常重要。人们为此对c-Abl进行了超过20年的研究。最近，生化和遗传的方法使我们对c-Abl激酶活性调控机制和c-Abl复制的细胞生理功能有了新的观点和启示。这篇综述总结了当前对c-Abl生物学各方向的探讨，重点是最近对果蝇和哺乳动物中Abl的研究。]
c-Abl 最初被认为是Abelson小鼠白血病毒中细胞恶性转化基因 的同源基因，接着发现它与白血病患者费城染色体 t(9;22)易位有关，并编码一种非受体Tyr激酶（见参考资料1）。哺乳动物中c-abl基因是普遍表达的，有两个可选择的带独立启动子的5'外显子，分别可形成5kb和6.5kb的mRNA,由此编码产生的蛋白质只是N-末端序列不同。c-Abl这两种多肽链，在人中称Ia和Ib，小鼠中称I型和IV型。
c-Abl主要的功能区在图一中标示的很明显，60kDa的N-末端是同c-Src及其他Src家族成员同源的区域，但是c-Abl在c末端有一独立的90kDa区域。Arg基因是c-Abl的同源基因，通过基因组DNA低水平严紧性筛查而识别，称为abl相关基因。arg与c-Abl基因编码、生成的蛋白质高度同源，N-末端很相似，但C-末端区域却有相当不同。c-abl基因在物种进化中一直保存完好，在果蝇和大象中都存在可辨认的相应物。
c-Abl的亚细胞定位
早期人们对c-Abl的研究集中在其细胞定位上，希望能获得发现它功能的线索。通过在小鼠成纤维细胞中过度表达IV型蛋白质首次对c-Abl进行了亚细胞定位，意外发现其主要存在于核中，但在细胞质中也有存在主要与肌动蛋白和细胞膜有关。
有一些组织，如初血红蛋白和神经里，c-Abl在细胞质中的含量比核中高。Ia和I型c-Abl基因过度表达是很困难的尽管它的位置认为和十四酰基化的形式相近，但这并没有直接得到论证。c-Abl在细胞不同组分中的位置由相区别的信号所决定，很可能是一个受到调节的过程。c-Abl有3个核定位信号（NLSs)，由c末端区短的基本序列组成，这三种信号只要存在其中任何一种，都足可以将Abl在核中定位。核中累集的Abl通过c末端的核输出信号介导其运输到细胞质中而平衡，此途径对淋巴B细胞非常有意义。细胞质中大部分过量表达的c-Abl基因都与F-肌动蛋白有关。F-肌动蛋白的定位需要c末端一个小区域与NES重叠存在。最后十四酰基化的c-Abl的一部分与质膜内表面相关联，并且，膜的定位需要Myristoyl基因。
多种细胞成分都含有c-Abl，表明这种蛋白质可能从细胞一处转移到另一处产生信号使细胞对生理刺激作出反应。另外认为也许c-Abl在不同成分中有明显不同的功能，一些观察表明这两种模型没有相关性。当成纤维细胞被胰蛋白酶作用并重新覆盖纤连蛋白，c-Abl会从核中重新定位到F-肌动蛋白富集区，并在一小时内返回核内。这表明c-Abl在整联蛋白诱导的信号途径中产生应答。通过免疫荧光技术分析，所有的恶性转化Abl蛋白亚细胞定位都在细胞质中，这表明Abl的恶性转化在细胞质中其作用。在那里Myristoyl基团的存在会使成纤维细胞的恶性转化容易进行，暗示Abl在粘连细胞恶性转化中起膜的功能。
对Abl基因缺陷老鼠的观察研究：
小鼠c-Abl基因是最先进行同源重组研究的基因之一，c-Abl重组产生ture null 等位基因和编码有完整激酶活性的截断Abl蛋白，有趣地是，因为两等位基因都敲除而产生相同表型的abl-/-小鼠先天发育不良，存活时间短，眼睛也不正常，直肠频繁下垂，精子缺损。一些小动物脾和胸腺会萎缩，淋巴细胞B、T也减少10-30倍，这些观察说明abl对复杂的细胞功能是必须的，其远侧c末端对实现c-Abl的 这些功能很重要。
小鼠的淋巴缺陷是否与造血系统无关还不能确定。因为abl-/-小鼠胎儿的肝脏或骨髓能重新组成血液淋巴系统，这说明在一些abl-/-小鼠观察到的淋巴球减少症只是次要的现象，也许只是因为紧张、肾上腺皮质醇水平升高。但用正常骨髓补救abl-/-小鼠的补充实验说明不可能是因为生存缺陷，所以可能是基质结合和血液淋巴的缺陷造成淋巴细胞数目减少。
c-Abl激酶活性调节
像c-Src一样，野生型c-Abl蛋白质即使过量表达也不会使成纤维细胞血红细胞恶性转化，这说明细胞内Abl的活性受到严格调节。尽管如此，生化和突变研究表明Abl激酶活性的调控和Src家族激酶不同。c-Src使由Csk和其它激酶使其c末端Tyr527磷酸化进行负调控，并认为当磷酸化 Tyr残基和Src SH2去以分子内形式复合在一起时c-Src处于失话状态。失活时，Src SH3区同SH2区和激酶区之间的连接区通过253位处一个Pro残基以不规则的相互作用相结合，通过去磷酸化、527位Tyr残基突变或缺失、或者反过来将SH3或SH2区突变都能激活c-Src，使细胞内蛋白质Try残基磷酸化程度升高，大多数这种情况会导致细胞恶性转化。形成对比的是。c-Abl在失活状态是非磷酸化的，缺少527位Tyr的同系物、截断Abl c末端或SH2区突变都不能在体内激活Abl蛋白。Abl SH3区缺失和点突变使其不能与富含Pro的SH3区的配体结合。使Abl被激活，从而c-Abl和其它蛋白磷酸化程度增高引起细胞恶性转化。
在Abl SH2区和激酶区之间的连接区使一个与Src里Pro253相当的Pro残基突变将使c-Abl的恶性转化作用激活。这表明类似于c-Src Abl SH3以分子间的方式抑制Abl激酶活性。尽管如此，与Src不同，c-Abl与SH3区突变的Abl在体内有相同的激酶活性，表明体内SH3突变产生影响是由于其失去了细胞内抑制蛋白的结合位点。这样的抑制蛋白可能是通过稳定结合在Abl SH3区和链接区Pro位点之间而发挥作用，因为在Src里相应的这种相互作用是低亲和的，并且随着Src Sh2区与Tyr527残基结合作用的失去而瓦解。Abl SH3区最初用来识别特殊的SH3区配体的，它和的几种Abl SH3区结合蛋白都是侯选的抑制蛋白，Abi-1和 Abi-2是两种包含SH3的同源蛋白，它们在同源区有相关的转录因子。Abi-1截断形式地表达阻止V-Abl的恶性转化作用。但当Abi-2截断形式和c-Abl 一起表达时却能诱导细胞恶性转化。因此，这些蛋白的功能看上区更像是效应蛋白而不是抑制蛋白。Aap1是一种体外抑制Abl 激酶活性的蛋白，但这些在体内却没有观察 到。Pag/Msp23是抗氧化物酶中家族中一员，可由血清、氧化压力诱导产生，当和c-Abl在体内一起表达时它会阻抑c-Abl蛋白的表达。需要更多工作来确定这些侯选蛋白中是否时体内c-Abl激酶活性的主要生理调节因子。
c-Abl在核中的功能
一些研究表明c-Abl在核中对细胞周期由调节作用。细胞周期的G1期c-Abl在核中的聚集比例与Rb蛋白相关。在这种情况中Rb c末端的口袋与c-Abl激酶中结合ATP的突出部位结合，从而抑制c-Abl激酶活性。G1与S期交界处，Cyclin D -cdk 4/6激酶使Rb磷酸化从而使c-Abl生成并在S期被激活。在S期c-Abl能将RNA聚合酶II c末端区域磷酸化，由可能激活S期基因的转录。这些观察表明c-Abl在S期也许能刺激生长的启动。实际上，转染c-abl基因会使Rb缺陷的Saos-2细胞终止依赖Rb的阻遏生长作用。尽管如此，一些研究与此模型并不一致。去除成纤维细胞的abl-/-小鼠在S期进程中并没有明确的缺陷，也没有实例说明哪个基因转录使依赖c-abl的。Rb作为核c-Abl的一种抑制蛋白而起作用，但是因为Abl SH3区对结合 Rb是不需要的，通过对Abl的突变研究 表明 Rb不太可能是Abl的抑制蛋白。
Abl在不同环境下阻抑细胞在G1期的生长。通过转染或条件表达的条件下c-Abl的过度表达c-Abl将使细胞阻遏在G1期，群体中一些重要的部分发生调亡。c-Abl对细胞的影响就是c-Abl在核中发挥的功能，需要AblSH2区和激酶活性及P53、Rb这些抑癌产物。得到这些结论的实验都牵涉到过度表达c-Abl蛋白，或用直接针对abl的反义寡聚核酸处理细胞，都会加速细胞缩短G1期进入S期，这表明阻遏G1期向S期的转化是c-Abl的一项生理功能，但期机制尚未清楚。
Abl激酶活性和SH2区对c-Abl发挥功能所必需这暗示在这过程中c-Abl有一个或更多的底物，但不太可能是 P53或Rb蛋白，因为它们没有观察到磷酸化的Tyr残基。c-Abl也许直接与P53相互作用，并微弱地刺激P53活性转移能力，但是此效应不需要Abl激酶活性，并且它与生长阻遏的关系也不清楚。有趣的是，在Pag/Msp23 SH3结合蛋白也一起表达时将抑制c-Abl的细胞效应，却不会抑制SH3突变的c-Abl蛋白，表明Pag/Msp23也许直接调控核内c-Abl的细胞效应。更复杂的是，c-Abl本身有结合DNA的能力，通过三个衔接重复与HMG蛋白同源的DNA结合区实现，这些结合区恰巧也就是c-Abl的三个核定位信号，说明这都是双功能区。
第二、第三结合区在原始区存在的情况下很容易结合DNA，但单独情况下却不能与DNA结合。尽管，类似于 HMG的蛋白的同源体是很激进的，相似程度却很低，并且c-Abl中也不可能有HMG蛋白中螺旋-转角-螺旋结构，因为这区域有大量脯氨酸存在。虽然最初报道c-Abl有能与DNA结合的特殊序列，随后的研究表明仅仅是对富含AT的寡核苷酸有微弱亲和力。Abl中DNA结合区的功能上的意义还不知道，尽管c-Abl对自身无转录能力，但V-Abl、c-Abl能与转录因子CREB、 E2F-1复合在一起并调节它们的转录活性，包括诱导c-Abl的转录。尽管如此，仍然不知道Abl这些辅助激活的功能是否需要DNA结合区，另一种可能就是Abl DNA结合区与DNA损伤应答有关。电离辐射和一些类辐射的化学物质如丝裂霉素C似乎能使核c-Abl激酶活性激活，活性提高3-5倍（根据免疫沉淀和体外激酶化验估计）
因为激酶活性是在免疫沉淀后观察的，这样可消除抑制蛋白的影响，看上去有可能是通过磷酸化对c-Abl直接调整而介导的。实际上，随后的研究证明c-Abl对电离辐射作出的应答中与ATM、Scid基因产物及DNA-PK(DNA依赖的蛋白激酶）相互作用并被它们磷酸化。遗传及突变研究为这些丝氨酸激酶和c-Abl之间功能上的联系提供了进一步的证据，辐射诱导c-Abl激酶活性的能力在 atm-/-细胞中缺失，且在Scid成纤维细胞中减弱，当使c-Abl激酶区中有一个侯选的ATM磷酸化位点(Ser465)突变也会终止辐射诱导 Abl的激酶活性。另外，c-Abl的一种侯选抑制蛋白Pag/Msp23具有抗氧化活性表明也许还存在对c-Abl其它水平的调控，由于c-Abl的激酶活性和电离产生的辐射将诱使Pag/Msp23氧化并与c-Abl蛋白分离。
激活状态的c-Abl使几种核内底物磷酸化，包括DNA-Pk、Rad51,、SHPTP1和磷酸肌醇3-激酶亚单元P85，对它们进行负调控。另外曾报道c-Abl对应力激活激酶/jun蛋白N末端激酶（SAPK/JNK）和相关的P38激酶在对辐射应答中是必需的。但在对肿瘤坏死因子应答却不是这样。尽管如此，对abl-/-小鼠胚胎成纤维细胞生理属性进行仔细观察表明许多这些应答中实际上并不需要Abl。Abl能在G1期阻遏细胞生长和辐射能激活Abl激酶活性的事实说明Abl在辐射阻遏G1期过程中发挥作用。曾报道，abl-/-成纤维细胞中在对辐射产生应答时，G1-S检测点产生缺陷，但随后的几个小组的研究都没有发现到这个缺陷。类似的是，辐射对JNK/SAPK活性看上去没有缺失。Abl与DNA-PK和Rad51之间相互作用很强烈，但是abl-/-细胞对断裂的双股螺旋DNA修复时并无缺陷，事实上看上去和abl+/+细胞有相近的抗辐射性。因此现有的生化和遗传研究证据都表明c-Abl 被genotoxic和可能的氧化压力经复合途径被激活，通过蛋白质相互作用和磷酸化在多个层次上被调节。因为细胞缺少c-Abl或Abl和其相关蛋白Arg时，在 DNA损伤修复或细胞周期进程中看上去无明显缺陷，所以在这过程中c-Abl一定是多余或稀少。很明显，仍需要更多地研究来探讨c-Abl在这些复杂的细胞内应答中确切作用。
c-Abl在细胞质中的功能：
与c-Abl在核中功能相比，对其在细胞质中的功能还了解甚少。很大部分Abl通过末端肌动蛋白结合区与细胞骨架的F-肌动蛋白相关联。这个区在体内对F、G-肌动蛋白都有明显的结合能力。两个区一起还能介导F-肌动蛋白细丝的捆扎。在体内，c-Abl浓度太低，不可能成为细胞内F、G-肌动蛋白的主要调节物。尽管如此，c-Abl有可能影响周围的细胞骨架。反过来细胞骨架介导的信号也会调整c-Abl的激酶活性。当把拆开的成纤维细胞再植入纤维组织中时，c-Abl会重新召集在一起，激酶活性有短暂提高。激活的机制仍不清楚，也许时由细胞骨架结合或传递信号介导。Abl由整合素介导的活性时伴随和Paxillin结合和磷酸化而产生的，Paxillin是一种功能未知的粘连蛋白。
c-Abl在细胞质中的另一种底物是c-Crk，Crk通过磷酸化Tyr残基而进行负调控，Crk SH2区与磷酸化的Tyr位点以分子内的形式结合。abl-/-成纤维细胞的提取物能明显降低c-Crk激酶活性，这暗示c-Abl是体内调节Crk的主要物质。活性状态的Crk与也会影响肌动蛋白微丝的Cas和c3G两种信号分子结合，从而加强c-Abl与细胞骨架之间的连接。果蝇中基因的研究表明：在果蝇胚胎发生过程中DAbl绝大多数在中枢神经轴突上表达。abl-/-苍蝇产生致死的蛹，神经系统总体结构无异常，但是在一些基因突变的杂合子里，如 dab，在胚胎期因为中枢神经系统轴突束完全瓦解而死亡。Dab蛋白是一种tyr磷酸化的受体蛋白，它有几个潜在的Abl磷酸化位点和类似Shc磷酸化、Tyr结合区。它在轴突中与Abl一起定位，并与Notch蛋白相关联，Notch是存在于神经生长锥体中的一种受体，相比之下，那些缺失DAbl而仅于一个enb基因的苍蝇能存活到成年，杂合态的enb突变也足够使abl-/- dabl-/-胚胎中轴突正常发展。Enb是一个富含磷酸化Pro、Tyr的轴突蛋白，在体内于Abl蛋白SH3区结合并和肌动蛋白抑制蛋白相结合的VASP。这些观察共同表明Dab和Ena作为Abl底物在轴突发生中通过Abl依赖的和非Abl依赖的途径发挥相互作用。
另外有遗传研究表明DAbl在轴突路径探寻和辨认目标起发挥作用，可能是由于它能通过跨膜粘连分子调节细胞粘连和通过肌动蛋白细胞骨架调节细胞运动。
abl和神经细胞粘连分子fas I双重突变的胚胎在结合轴突的途径中表现出缺陷，并表现出在单一突变中并不表现的锥形生长，这暗示DAbl和FasI 通过结合控制轴突导向的信号途径中起作用。相似的是，DAbl和果蝇Arm同时突变将诱使中枢神经严重瓦解，并使在arm单突变中观察到的前部神经束微弱缺陷得到加强。这说明DAbl可能与 Arm相互作用，Arm也是神经中的一种Tyr激酶，能提高集合度、保持接口相连接。最近的工作证明在DAbl介导的Tyr磷酸化和轴突中驱动神经指导的Tyr磷酸化酶使Tyr去磷酸化存在平衡。在节间神经b(ISNb)中对'旁路'突变进行遗传筛查（ISNb存在于CNS中 但是不能与前部周围的肌肉相连）发现一些基因包括跨膜Tyr磷酸化酶Dlar、DPTP69D和DAbl抑制基因ena。
失去DAbl 功能的杂合子阻抑Dlar的旁路表型，说明在控制ISNb轴突途径探寻时 Abl Tyr激酶活性与Dlar Tyr磷酸化酶活性处于相反的状态。与此一致的是神经中的 DAbl的过度表达也会诱导产生旁路表型。Dlar在体外被DAbl磷酸化并且通过它的胞质区与DAbl和Ena两者都能结合。另外，在DAbl蛋白和果蝇编码肌动蛋白抑制蛋白的基因表达诱导ISNb轴突产生一样的锥形生长阻遏。尽管明确其中的生化途径需要进一步研究，这些观察揭示这样一个模型：DAbl在CNS的轴突锥形生长中起作用，周边神经组织的神经与其它Tyr激酶化酶保持一致，从而影响轴突的途径探寻和连接，也许通过Ena和Profilin的活性直接调节细胞骨架的肌动蛋白。最侯几项观察表明哺乳动物 c-Abl在神经发育中也起作用。通过相关基因arg突变研究揭示了神经胚中十直接需要c-Abl。arg-/-小鼠发育上常表现一些非正常的行为，表明其神经功能有缺陷。尽管如此Abl和Arg都缺乏的胚胎在发育的11天死亡。因为神经管大都有缺陷且表皮神经细胞骨架的肌动蛋白显得杂乱。因为Arg蛋白只存在于胞质中，这表明Abl和Arg在胚胎CNS细胞质中有冗余的细胞质功能，实际上这两种激酶彼此相互间定位以及在表皮神经表面于肌动蛋白细丝辅助定位。对衰退大鼠的突变和人类系谱的研究表明 c-Abl也许在周质发育的后期也发挥功能。哺乳动物的大脑皮层有六个明显的神经层，产生于侧面相邻的胚胎前体，随着经内外迁移形成神经。Scrambler是一种衰退小鼠突变，其中纯合子表现为大脑失调畸形和完全地皮层神经层缺失。
Scramble基因编码mDable的小鼠同源蛋白，像它的果蝇同类物一样，是Tyr被磷酸化包含PTB受体蛋白，在皮层神经发育中表达。有与x染色体关联的lissencephaly/double cortex综合症的病人，典型的特征是皮层神经总量发生缺陷地迁移，从而导致迁移阻遏在亚皮层白物质中，这些病人在肾上腺皮质激素中都有突变，肾上腺皮质激素是含有潜在Abl磷酸化位点的一种新的大脑特异信号蛋白。其它的研究结果揭示出在大脑发育中c-Abl下游的生化途径。P35是普遍表达神经特异的Cdk5激酶调节亚单元，缺乏p53的小鼠具有活力并能生育，但对捕获的敏感性提高并对正常地大脑皮层的叠片结构样式是近似完全地失明。p53除开能结合和激活分裂后神经中的Cdk3，也能和一种叫做Cables的新受体蛋白作用。Cables能与c-Abl结合并使cdk5更易被Abl进行Tyr磷酸化，这对p55/Cdk5激酶活性产生刺激。p55/Cdk5在神经中的底物包括p21(ras)激活的激酶PAK1,当PAK1被cdk5磷酸化时，其活力被抑制并可能调节细胞骨架肌动蛋白。哺乳动物皮层神经迁移是一个复杂的过程，这些各种各样的基因产物之间的生化关联大部分都还没确定。尽管如此，对一些数据的观察揭示了一个信号模型，与生化研究有牢固基础的果蝇有相似性。
[结论和展望]
过去的七年中在弄清楚 c-Abl的复杂和多重生物学功能有了很大进步。c-Abl在细胞周期调节、压力应答、信号转导和神经发育中扮演相似的角色。尽管有这些进步，但现阶段仍不可能有Abl的一个单独全面的功能模型。在不远的未来，期待在一些方面有所进展。哺乳动物的c-Abl的晶体结构模型中也许活性和与抑制蛋白复合在一起的两种形式都存在，使我们可以更深入地观察研究c-Abl的调控。
对abl含量不足的初级细胞包括从更复杂的条件突变得到的细胞仔细进行的生化和遗传分析应该可以弄清楚Abl在细胞周期调控和压力应答中的作用。在苍蝇、小鼠和人用传统方法和反向遗传血方法与体外神经发育模型中的生化分析一起进行研究，将会使Abl在轴突遗传和神经迁移中的作用更加清楚。最终，我们面临的新的挑战就是应用最新获得有关Abl功能的知识去探寻人类 Philadelphia-positive 白血病的分子异常机理，长远的目标是提高这些疾病的治疗水平。
