台湾交大习题,或可参考.
原作:莊榮輝 博士
非常感谢!!
蛋白質基本性質：
1. 兩蛋白質分子間的微弱作用力稱之為二級鍵的有那些？
2. 把 NaCl 固体溶入水中，其 △Ｇ小於零，但巨觀為一吸熱反應，解釋為何？
3. 為何分子內含有較多親水性胺基酸的蛋白質，在水環境中會相對的較不安定？
4. Domain 的形成，對生物在分子演化上有何優點？
5. 分子間的專一性吸引力由那些力量與因素構成？
6. 列表說明蛋白質分子的各級構造，及其組成及鍵結力量。
7. 以一個接近球形的蛋白質為例，請以想像畫出一個酵素蛋白質分子的大概形狀，並在其分子表面畫上各種可能的物理或化學特徵 (如正負電荷、非極性區、活性區等)。
8. 酵素與其基質之間的結合，有很強的專一性，請以生物化學觀點說明二者之間為何能有如此強的結合力量？ 有那些方法可以有效地破壞這種專一性的結合力？ 請至少寫出五種方法。
9. 上生化課時，不斷提到胺基酸基團的重要性，請寫出在生化上受到胺基酸基團性質所影響的現象、性質或構造，至少十種。如蛋白質 pI 是由其所含胺基酸帶電性所決定。
10. 由蛋白質的一級構造就可以推定其三級立體構造嗎？ 請分別以正、反兩方說明之。
11. 為何蛋白質的 構形 (conformation) 對其生理活性非常重要？
12. SP 分子是由兩條 110 kD 的次體所組成，當分子中央的 L78 被切開後，在 SDS-PAGE 上可看到它成為一群分子量約在 50 kD 的片段；但在 disc-PAGE 上卻仍保持約 200 kD 的分子量，而且經活性染色仍有相當高的酵素活性。說明 SP 分子如何能有上述現象。
13. 以酵素催化反應的中間過渡狀態分子去免疫動物，製備並篩選單株抗體，即獲得可以催化此反應的抗體 abzyme； 請說明這個過程的原理。
14. Abzyme 的催化活性一般都不高，與真正的酵素催化還差一段距離。 請比較二者的異同，並解釋為何有如此差異。
15. 氫鍵在分子構造與功能上十分重要，以蛋白質或酵素為主体對象，請列出十種構造或分子行為，與氫鍵有重要關係。 例如蛋白質的 a-helix 構造中是以氫鍵做為主要構成力量。
16. Hemoglobin 的例子告訴我們，為了正確的生理功能，維持蛋白質分子的構形比較重要，還是維持其中的胺基酸序列的保守性比較重要？
17. 酵素的活性區 (active site) 是酵素與其基質結合，並且催化反應產生生成物的地方，請問活性區與酵素的其它部位，到底有何不同或者特殊的地方，使得活性區能有這些奇妙的催化作用？
18. 蛋白質分子是由胺基酸分子所連接而成的巨分子，並且捲繞成固定的構形，以便發生特定的生理功能。 二十種胺基酸的 a-基團對酵素的催化作用有極大貢獻，這些基團的電荷有正有負，有長有短，有大有小，有極性有非極性。 雖然如此，為何有些酵素還需要輔脢的幫助？
19. 為何 RNA 可以有類似酵素的催化作用，而 DNA 則沒有這種能力？
20. 由分子選殖所得到的 cDNA 序列，可以推出某酵素的胺基酸序列，也因此可以算出該酵素可能的分子量；但在實際推算時，經常發現實際的分子量不符，有過大者、也有過小者。 請分別舉出分子量變大或變小的可能原因。
蛋白質基本性質： 酵素純化方法：
酵素純化方法：實驗室操作
1. 請指出酵化實驗室中，有那些 儀器 可能具有危險性？ 請至少例舉三種。
2. 請指出酵化實驗室中，有那些 藥品 可能具有危險性？ 請至少例舉三種。
3. 在使用天平之前，你要注意那些事項，以求得最精確的稱量結果？
4. 沒有正規的校正儀器時，你如何利用實驗室內的工具大略檢測天平的準確度？
5. 若沒有標準 pH 溶液時，你如何利用實驗室內的物品校正 pH meter？
6. 如何很快地校正自動吸管？
7. 台大在暑假期間常常因限電或颱風而停電，你好不容易把你的實驗材料準備好，是十瓶裝有 20 mL 蛋白質溶液的粗抽取液，你將如何使你的樣本在台大安然度過暑假？
8. 做 ELISA 時要用一種 second Ab-HRP 的連結体試劑，是把抗体分子與酵素 HRP 用化學鍵連在一起的呈色劑，HRP 在反應後可以呈現黃色物質，可供定量之用。 某生在兩個月內持續進行 ELISA 實驗，發現實驗所得的最大吸光度，一週一週下降，由最早的 1.2 降到 0.2。 已知抗体及 HRP 都是相當穩定的蛋白質，分析的各個步驟也沒有問題，請指出可能的失誤在那裡？
9. 某生進行高速離心時，使用四隻 30 mL 的離心管，把試管兩兩各自平衡得非常準確，才放入離心陀中進行離心。 但開始不久離心機就聲響大作，顯然是沒有平衡好。 請問怎麼會這樣？
10. 某生用光度計測 280 nm 波長的吸光，以檢測層析管柱的溶離分劃共 50支試管，結果發現 50 支的吸光一律都很高，超出了可測定的上限，請問出了那些可能的問題？
11. 續上題，老師知道之後，換了一支測光管給他，結果稍有改善，勉強可以看出有蛋白質峰起伏，但吸光還是都在 1.5 以上，請問又是什麼問題？
12. 有一種酵素藥品，買來時是 1 g 瓶裝粉末，要放在 -20℃保存。 若你每次要使用 50 mg 做實驗，大約要進行十多次實驗，則你將如何處理這瓶酵素？
13. 某實驗室新買一無霜冰箱，有甲乙丙丁四位同學分別把他們的藥品 X 放到冷凍櫃去保存，經過一個暑假的貯藏後，甲發現活性只剩 30%，乙只剩 50%，丙剩 75%，而丁則有 90%。 除了暑假有一次因颱風停電數小時外，他們確定沒有人故意搗蛋。 請問為何活性會下降？且為何會有這種差別情形？
蛋白質抽取
1. 某甘藷塊根蛋白質由粗蛋白經純化 100 倍後達到均質，活性回收率約有 50%，則此蛋白質在原甘藷材料中約佔多少百分比？
2. 若蛋白質分子表面幾乎沒有疏水性胺基酸，則它容不容易 salting out 出來？
3. 為何蛋白質變性後容易沉澱下來？
4. 為何硫酸銨沉澱是以百分飽和度來計量，而非重量或体積百分比？
5. Salting out 的相反程序是否為 salting in？
6. 樣本以較低離子濃度的緩衝液透析，可否視為 salting in 的相反程序？
7. 在純化過程中，經過硫酸銨分劃後，發現比活性僅增加為 1.1 倍，則此一純化步驟有無存在必要？ 請解釋為何。
8. 使用有機溶劑沉澱蛋白質，比之鹽析分劃有何優缺點？
9. 能否用純水去溶解蛋白質？ 說明為何？
10. 用有機溶劑沉澱蛋白質時，為何要在低溫下進行？
11. 植物細胞比動物細胞要難以處理，請問植物細胞有那些特有問題？
12. 植物細胞在打破之後，其抽出液很容易變成褐色，其原因何在？ 如何防止？
13. 用 PEG 4000 可以把蛋白質沉澱下來，但接著你如何除去這些 PEG？
14. 為何硫酸銨是一種中性鹽類？
15. 為何蛋白質在硫酸銨的沉澱中比較穩定？
16. 加硫酸銨進行鹽析時，若把預定加入的硫酸銨固体一次倒進蛋白質溶液中，會發生什麼問題？
17. 硫酸銨分劃時，各分劃的酵素分佈應當是以其總活性來評量，而非使用比活性，請說明為何。
18. 用有機溶劑沉澱蛋白質時，為何會產生熱量？
19. NaCl 或 KCl 會使蛋白質在水溶液中的溶解度上升，而硫酸銨或硫酸鈉反而會使蛋白質溶解度下降，為何兩種鹽類會造成這樣的差異？
20. 通常在純化核酸時，較麻煩的干擾物質不是蛋白質，而是多醣類，很不容易完全去除之，請以化學構造的觀點說明之。
21. 蛋白脢可略分成四大類，請分別說明其作用機制如何。 並請列出每一類的抑制劑。
22. 有一位研究生經常要做免疫球蛋白的簡單分離與純化，他一直在實驗桌上放了一瓶硫酸銨溶液，雖然說是水溶液，但硫酸銨固体卻因過飽和而結晶在瓶底，且結晶數量不少。 每次他要做硫酸銨分劃時，只要加入與樣本同体積的這種硫酸銨溶液 (上清部份)，就可以把抗体沉澱下來。 請問他這種做法適當嗎？ 有何應該注意之處？
色層分析法
1. 層析法為何一定要有兩相系統？ (一相不行嗎？ 三相不是更好嗎？)
2. 為何濾紙層析法 (PPC) 是一種 partition (液相-液相) 層析？
3. 用 Sephadex G-25 脫鹽時，若因離子濃度改變，而致蛋白質發生沉澱，對實驗有何不利之處？
4. 通常脫鹽的 Sephadex G-25 管柱均製成可丟棄式，這種消耗有必要嗎？
5. 為何膠体過濾法是一種 partition 層析？
6. 在進行離子交換法時，為何樹脂類的介質 resin 不適用在蛋白質樣本？
7. 某蛋白質的 pI 是 4.2，若把緩衝液調到 8.5，則在此緩衝液下，應當使用那一種離子交換介質？ 請問在這樣的 pH 下進行離子交換層析，可能會有什麼問題？
8. 為何 pH 的連續梯度不容易拉得好？
9. 薄層層析 (TLC) 可有 partition 及 adsorption 兩種層析方式，各是如何操作的？
10. 一隻直徑 2.6 cm 的管柱，長度 100 cm，想要裝填 Sepharose CL-6B 至八成的高度。 現有一瓶原裝的膠体，瓶子上面標明有膠体 750 mL，靜置後膠体沉降体積約佔四分之三的高度，其餘為上清液。 你當如何取用膠体，剛好可以裝填所要的膠柱。
11. 每年四、五月間，是研究生趕畢業的繁忙時段，冷房經常堆滿管柱，空間不敷使用。 有一研究生沒有找到位置，不得已只好在室溫下跑膠体過濾，為了怕在室溫停留太久，又把流速增加 20%。 結果出乎意料之外，出來的蛋白質峰都比原來在冷房裡跑的還集中，活性也稍稍增加。 請解釋這個現象的可能原因。
12. 某生以 Sephacryl S-100 膠體過濾法分離某蛋白質，通常此蛋白質都在大約 35 管分劃的地方溶離出來。 但經春假放假三天回來，開動工作重新裝填管柱，各種緩衝液也重配；卻發現蛋白質居然要在 60 管才會溶離出來，酵素總活性也降到三分之一。 檢討他所用的管柱大小相同，所用的分劃收集器及分劃体積也都沒變，請問毛病可能出在那裡？
13. Hydroxyapatite 是何種物質？ 它是如何分離開單股與雙股 DNA？
14. 有一次停電數小時之後，某生發現冷房內的管柱中，膠体都充滿了氣泡，請問是何原因？ 但他發現旁邊另一位同學的管柱膠体卻都沒有氣泡產生，又是為何？
15. 甲乙兩人同時要用 DEAE 型式的陰離子交換法純化酵素，甲生有最好的管柱 (有 adaptor)、梯度製造器、蠕動幫浦，而乙生除了有點錢買膠体及簡單的藥品或用具之外，什麼都沒有。 經過一週後，在結果報告上，乙生的結果卻遠比甲生要好，活性及純度都較高，他是如何辦到的？
16. HPLC 與 FPLC 系統有何異同？
17. 進行離子交換法時，我們是採用較高的鹽濃度把蛋白質溶離下來，請說明為何高鹽濃度可以把吸附在膠體上的蛋白質洗下來？
18. 進行離子交換法以鹽梯度溶離蛋白質時，若要分開兩個很相近的蛋白質峰時，有時會有下列現象發生，請說明為何：
a. 拉連續梯度不如階段 (stepwise) 梯度
b. 使用較長的膠柱不如較短的
c. 使用較寬的鹽梯度 (0 - 0.5 M) 不如較窄的 (0 - 0.2 M)
d. 使用的溶離體積較小的 (如 150 mL×2) 不如較大體積者 (如 200 mL×2)
19. 血清蛋白質的 pI 大多在 7 以下，只有抗体 IgG 的 pI 為 8.3，請設計一離子交換程序，使用 DEAE-Sephacel，可以很快地純化 IgG。 另外，IgG 的分子量約為 160,000，而另一類抗体 IgM 的分子量為其五倍多，請問你要用何種方法來純化 IgM？
20. 親和層析法是 partition 或 adsorption 層析？ 親和層析法為何要使用固相擔体？
其他純化方法
1. 進行製備式電泳時，明明只切出一條所要的色帶，為何再跑一次分析式電泳時 (SDS-PAGE)， 往往會出現其它的色帶？ 有那些可能的情形？
2. 進行超高速離心時，大分子的那些因素會影響其沉降速率？
3. 為何 CsCl 可以在超高速離心的過程中自動形成密度梯度？ 而蔗糖或甘油不能？
4. 進行 zone centrifugation 時，若離心過久而不適時停止，則所有的蛋白質會不會全部沉降在離心管底部？ 為什麼？
5. 垂直式離心是如何進行的？ 為何它能在短時間內達到分離效果？
6. 超微薄膜過濾與傳統過濾法有何不同？ 超微薄膜過濾操作時的最大問題是什麼？
7. 以硫酸銨可以沉澱蛋白質下來，不但有蛋白質分劃效果，也可做為濃縮的步驟；但與冷凍乾燥及真空離心等濃縮方法，有何共同的問題，會影響下一步純化步驟？
8. 某些情況下超微薄膜過濾的確對增進蛋白質的純度有所幫助，那是如何操作的？
9. 連續使用兩次相同的純化方法，經常無法得到高效率的純化效果，請解釋原因。
10. 某生在進行硫酸銨分劃，收集得蛋白質沉澱後，以最少量緩衝液溶之，得到 20 mL 粗抽取液。 接著想進行膠体過濾，因管柱大小只能容納 10 mL 樣本，於是他用超微過濾法把樣本溶液濃縮成 10 mL，以進行下一步。請問他這樣做有無意義？ 有什麼問題發生？ 若是你將如何處理？
11. 有那些純化方法是利用蛋白質的等電點不同來分離的？
